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LB膜分析儀-α-短螺旋抗菌肽對癌細胞選擇性及其抗癌作用的分子機制:結果、討論、結論、致謝!

來源:上海謂載 瀏覽 27 次 發布時間:2022-02-28

3.結果


3.1.體外抗癌能力和選擇性


G(IIKK)nI-NH2(n?1e4)肽是通過Fmoc固相肽合成協議[9e11]合成的。CD研究表明,這些肽主要存在于緩沖溶液中的無序結構中。在添加到DPPG(二棕櫚酰磷脂酰甘油)SUV(模擬帶負電荷的細菌和癌細胞膜的小單層囊泡)中后,除了GIIKKI-NH2外,肽采用a-螺旋構象。兩親螺旋結構有利于它們與脂質雙層的相互作用,但GIIKKI-NH2始終保持未折疊狀態,無論周圍環境發生任何變化。二級結構的這種缺乏變化與其缺乏生物活性很好地一致。隨后的細胞研究集中于n?2、3和4的系列。


按照濃度依賴性模式,重復次數較多或長度較長的肽在殺死癌細胞(HeLa和HL60細胞)方面更有效,但對正常細胞(紅細胞和HDFa細胞)的體外毒性也開始增加,如圖1aec所示??偟膩碚f,就體外抗癌活性和細胞選擇性而言,G(IIKK)3I-NH2是最佳序列,其對HeLa和HL60細胞的IC50值為15和25 mM,EC50遠大于250 mM(IC50:濃度導致50%的癌細胞生長抑制;EC50:濃度誘導50%的紅細胞溶解)。重要的是,HDFa細胞對這些肽有良好的耐受性,例如,在濃度低于50 mM時,G(IIKK)3I-NH2對HDFa細胞的影響微不足道(圖1c)。我們合理設計的短肽的這種性能明顯優于天然AMP,如馬蓋寧和蜂毒素,并且在有效性、選擇性甚至耐藥性方面也優于抗癌藥物順鉑[12e15]。例如,在類似的實驗條件下,magainin-2對HeLa細胞的IC50低于60 mM,而蜂毒肽在5 mM下的EC50則低得多,顯示出對宿主細胞的高毒性[12e14]。

圖1。設計的a-螺旋肽的細胞毒性和選擇性。(a)對HeLa和HL60細胞的細胞毒性。(b)人類紅細胞溶血。(c)對HDFa細胞的細胞毒性。(d)FITC-G(IIKK)3I-NH2在含有HL60癌細胞和HDFa原代細胞的體外共培養系統中的分布。


然后,我們進一步評估了基于體外共培養系統的細胞選擇性,該系統包含HL60癌細胞和HDFa原代細胞,它們與體內環境非常相似[8]。將最終濃度為20 mM的FITC-G(IIKK)3I-NH2添加到系統中,培養1 h后,用熒光顯微鏡觀察兩種細胞中的肽分布(圖1d)。很明顯,綠色熒光集中在懸浮和圓形HL60細胞中,而不是粘附和紡錘形HDFa細胞中,這再次表明肽具有良好的細胞選擇性,以及對癌細胞的快速識別。


3.2.肽與脂質單層的選擇性相互作用


在這個階段,這些肽的選擇性背后的機制過程在很大程度上仍不清楚,但抗癌肽主要是膜活性的,它們對癌細胞的作用方式涉及膜破壞。此外,它們對癌細胞的選擇性殺傷與癌細胞的兩個關鍵細胞膜特征密切相關,即凈負表面電荷和更大的膜流動性[2,3,16]。為了了解肽和細胞膜之間的特殊相互作用以及分子水平上抗癌作用的基本過程,我們轉向使用脂質單層的膜模型。圖2a顯示了在最終濃度為3 mM的條件下,將G(IIKK)(2e4)I-NH2注入亞相時,DPPC(二棕櫚酰磷脂酰膽堿)和DPPG單層(分別模擬正常哺乳動物宿主細胞和癌細胞外膜)的表面壓力從不同的初始表面壓力(pi)增加(Dp),同時保持表面積不變。所有的肽都表現出對帶負電荷的DPPG單層的明顯偏好,而對兩性離子DPPC單層的親和力則要小得多。在Dp?0處對每個壓力圖進行外推,得出排除壓力,超過該壓力,肽不再能夠穿透脂質單層,從而導致表面壓力進一步增加。對于兩性離子DPPC單層,G(IIKK)2I-NH2的排斥壓力為23.4 mN/m,遠低于生物膜的30e35 mN/m生理范圍[17,18],這與其對紅細胞的毒性很小相符。相比之下,G(IIKK)(3e4)I-NH2的值分別增加到32.0和37.6 mN/m,這與它們的溶血活性增加一致。另一方面,對于帶負電荷的DPPG單層,排斥壓力分別顯著增加至37.3、40.6和42.6 mN/m,表明陽離子肽電荷和陰離子脂質頭基團之間的靜電相互作用起著關鍵作用。盡管DPPC和DPPG單分子膜對G(IIKK)2I-NH2的排斥壓差較大(參見補充數據,圖S1),但其對后者的排斥壓僅略高于生物膜30e 35 mN/m的生理范圍,這與其殺死癌細胞的效率較低一致,因此,這種肽在癌癥治療中沒有吸引力。另一方面,G(IIKK)4I-NH2對兩性離子DPPC單分子膜的排斥壓力為37.6 mN/m,略高于30e35 mN/m的生理范圍,這與該系列中表現出的最高溶血能力一致。G(IIKK)3I-NH2顯示出中間值,DPPC單層的Dp值為32.0 mN/m,DPPG單層的Dp值為40.6 mN/m,這與體外細胞工作中的最佳細胞選擇性一致。

圖2。肽與不同脂質單層的相互作用。(a)當肽以3 mM濃度注入亞相時,在不同初始表面壓力(pi)下,DPPC和DPPG單分子膜的表面壓力增加(Dp)。(b)將G(IIKK)3I-NH2注入DPPC和POPC單分子膜的亞相后的表面壓力與時間的關系。


癌細胞中膽固醇水平的降低和具有不飽和脂肪酰鏈的脂質的增加可能是膜流動性增加的原因[19]。將最終濃度為3 mM的G(IIKK)3I-NH2注入亞相后,飽和DPPC和不飽和棕櫚酰油酰磷酰膽堿(POPC)單分子膜的平衡表面壓力增加趨于3.5和10 mN/m,初始表面壓力為30 mN/m(圖2b),表明無論膜電荷相互作用如何,增加的膜流動性確實有利于表面活性肽的膜滲透。


3.3.肽的原位定位和質膜完整性


為了在與HeLa細胞孵育期間精確定位抗癌肽,使用濃度為10 mM的FITC-G(IIKK)3I-NH2,并使用激光共聚焦顯微鏡觀察其在這些細胞中的熒光分布,與孵育時間有關。孵育1小時后,大部分FITC衍生信號(綠色(網絡版))位于HeLa細胞膜上,在細胞質內觀察到相對較弱的熒光信號(圖3a),表明細胞周圍的膜是這一時期的主要靶點。然而,孵育24小時后,熒光信號在細胞內積累(圖3b),表明肽穿過外脂雙層的易位。此外,處理24小時后,細胞邊界變得明顯模糊,這可能是因為在此過程中細胞膜的結構逐漸退化。因此,人們很好地預期,在易位后,肽會與細胞內靶點(如線粒體)相互作用,觸發細胞凋亡。

圖3。肽的原位定位和質膜完整性。(a)用10mM FITC-G(IIKK)3I-NH2孵育1h后HeLa細胞中的肽位置。(b)用10mM FITC-G(IIKK)3I-NH2孵育24h后HeLa細胞中的肽位置。(c)未經處理的HeLa細胞的代表性SEM顯微照片。(d)用10mM G(IIKK)3I-NH2處理24小時的HeLa細胞的代表性SEM顯微照片。


為了確定與肽結合后的膜通透性,我們進行了鈣黃綠素AM釋放試驗。與10 mM G(IIKK)3I-NH2孵育10 min導致約20%的鈣黃綠酸從HeLa細胞中釋放,表明其對癌細胞膜的快速滲透作用(參見補充數據,圖S2)。正如預期的那樣,增加培養時間會導致更多的膜通透性,在培養6小時后,鈣黃綠素AM的釋放超過40%。在較短的培養時間內,明顯的膜通透性與上述觀察到的肽與癌細胞膜的快速結合非常一致。


為了直接觀察G(IIKK)3I-NH2對細胞形態的影響,特別是在大多數肽分子轉移到膜上的較長培養時間后,我們進行了SEM檢查。未經處理的HeLa細胞顯示出正常的光滑表面,相鄰細胞之間具有良好的細胞間接觸(圖3c)。相比之下,用10 mM G(IIKK)3I-NH2處理24小時的HeLa細胞在細胞形態上表現出明顯的改變(圖3d)。觀察到收縮的細胞膜明顯破裂和溶解。除了細胞膜損傷外,一些處理過的細胞表現出嚴重的表面起泡(圖3d的右圖),這是細胞凋亡執行階段的特征性事件[20]。


3.4.細胞凋亡


由于肽易位到細胞質中,并且治療后的癌細胞出現了凋亡形態學,我們隨后遵循了細胞凋亡的幾個關鍵生化和形態學特征,旨在將凋亡誘導與HeLa細胞死亡聯系起來,并揭示可能的凋亡途徑。


3.4.1.核形態變化與DNA斷裂


染色質凝聚與DNA片段化平行是用于識別細胞凋亡的可靠標準[21]。通過對細胞進行DAPI染色,我們首先比較了在37C溫度下用10 mM G(IIKK)3I-NH2處理24小時前后HeLa細胞的細胞核變化(圖4a)。未經處理的HeLa細胞的細胞核形態規則且完整,彌漫性DAPI染色。相反,隨著熒光強度的增加,肽處理的細胞核形狀發生改變,染色質聚集成不規則的致密團塊。此外,在不同的培養時間從處理過的HeLa細胞中提取基因組DNA,然后通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析。孵育12小時后,出現寡核苷酸大小的DNA片段,并且隨著孵育時間的增加,模式變得更加明顯(圖4b)。相比之下,從未經處理的HeLa細胞中分離的DNA條帶是單一的,沒有發生DNA斷裂。有人提出,一旦染色質完整性受損,一些激活酶(如內源性核酸酶)負責將染色質DNA切割成180e200 bp的片段及其整數倍[22e 24]。

圖4。細胞凋亡的生化和形態學特征。(a)HeLa細胞與10 mM G(IIKK)3I-NH2孵育24小時前后的DAPI核染色。(b)HeLa細胞與10 mM G(IIKK)3I-NH2孵育后提取的基因組DNA的凝膠電泳分析。(c)在與10 mM G(IIKK)3I-NH2孵育24小時之前和之后,用FITC phalloidin對HeLa細胞進行F-肌動蛋白染色。


3.4.2.細胞骨架改變


肌動蛋白細胞骨架在介導細胞對內部和外部信號的反應中起著至關重要的作用[25]。它有一個動態結構,具有獨特的形式,適用于運動、粘附、分裂和細胞死亡等特定任務[26e28]。異常F-肌動蛋白動力學的發生與細胞凋亡的發展密切相關,通常伴隨著ROS的線粒體釋放[28]。在與10 mM G(IIKK)3I-NH2孵育之前和之后,用FITC phalloidin對HeLa細胞進行染色,以顯示F-肌動蛋白(絲狀肌動蛋白)。對于未經處理的細胞,纖細的微絲束平行于細胞的長軸,而F-肌動蛋白隨著處理的細胞變得紊亂和縮短(圖4c)。


3.4.3.線粒體途徑


線粒體在細胞凋亡中起著核心作用,凋亡死亡中的許多關鍵因素和事件都受其調控。一些凋亡蛋白可以靶向線粒體,通過形成膜孔或增加線粒體膜通透性導致線粒體腫脹。這兩個過程都允許釋放凋亡效應器[29e32]。在這項工作中,成功地觀察到線粒體途徑與細胞凋亡有關。我們首先以JC-1為探針,觀察線粒體膜電位的變化[33]。未經處理的HeLa細胞顯示線粒體橙紅色熒光和少量綠色熒光(網絡版)。與10 mM G(IIKK)3I-NH2孵育24小時后,綠色熒光占主導地位(圖5a),表明線粒體膜電位顯著喪失。線粒體膜電位的這種去極化通常伴隨著線粒體膜通透性的增加和Cyt c的釋放[34]。然后,我們進行了免疫熒光成像,該成像顯示未經處理的細胞中Cyt c的清晰、顆粒狀染色模式,與G(IIKK)3I-NH2處理的細胞中Cyt c的更彌散染色形成對比(圖5b)。這種差異表明細胞色素c從線粒體釋放到細胞質中,與觀察到的線粒體膜電位去極化高度一致。在細胞質中,釋放的Cyt-c可以在dATP存在下誘導Apaf-1和caspase-9之間的相互作用,從而進一步激活caspase級聯反應并觸發細胞凋亡[35]。


圖5.圖5。線粒體功能障礙與Fas-FasL通路。(a)用10mM G(IIKK)3I-NH2孵育24小時前后HeLa細胞的JC-1線粒體膜電位染色的熒光圖像。(b)用10mM G(IIKK)3I-NH2孵育24小時前后HeLa細胞的Cyt c免疫熒光染色。(c)Caspase-8,與10 mM G(IIKK)3I-NH2孵育后HeLa細胞的fas-L和fas基因轉錄。


3.4.4.死亡受體途徑


線粒體調節的細胞凋亡可通過其他受體相關途徑放大,如Fas與其配體(Fas-L)的相互作用[36]。為了研究該肽是否啟動了死亡受體途徑,我們進行了實時PCR分析,以分析相關基因轉錄(caspase-8、fas和fas-L)。10mM G(IIKK)3I-NH2處理的HeLa細胞在3至6h內的caspase-8轉錄水平明顯升高,而在孵育12h后急劇下降至正常值。fas和fas-L的轉錄遵循相同的趨勢(圖5c)。兩個基因(fas和fas-L)的高表達增加了它們相互作用的機會。這兩種分子的結合誘導了死亡誘導信號復合物(DISC)的形成,其中含有半胱天冬酶-8和半胱天冬酶-10[36,37]。Fas圓盤啟動了一個反饋回路,螺旋上升,增加了線粒體促凋亡因子的釋放和caspase-8的放大激活[38]。另一方面,半胱天冬酶-8誘導的凋亡也可以通過刺激線粒體釋放Cyt c來放大[39]。在G(IIKK)3INH2處理的HeLa細胞中,死亡受體通路基因的高轉錄意味著該肽誘導的細胞凋亡也參與了死亡受體依賴的方式。


3.5.免疫效應


從活生物體中分離的天然抗菌肽在臨床上的應用非常有限,因為它們的生產成本高、溶血性高以及可能的免疫效應[16]。除了通過高細胞選擇性降低生產成本和溶血作用外,所設計的螺旋肽的非免疫效應對于開發其潛在應用也至關重要。兩個細胞因子基因IL2和IL8被認為是主要的免疫系統信號分子,它們能夠對微生物感染做出反應,并將外來分子(非自身)與人體自身細胞和分子(自身)區分開來[40,41]。因此,這兩個基因的高表達通常會誘發急性和慢性炎癥。因此,在用肽G(IIKK)3I-NH2處理人類淋巴細胞后,使用RT-PCR分析其細胞因子基因IL2和IL8的轉錄水平。如圖S3所示,肽培養后淋巴細胞的IL2和IL8的相對轉錄水平低于或幾乎等于相應對照組的水平,表明G(IIKK)3I-NH2與淋巴細胞的相互作用不會誘導非特異性免疫原性反應。


3.6.體內抗腫瘤性能


將人宮頸癌HeLa細胞接種于裸鼠皮下。腫瘤植入5天后,分別以1.5 mg/kg和5 mg/kg的劑量腹腔注射肽G(IIKK)3INH2和G(IIKK)4I-NH2。在給藥期間,未觀察到任何毒性跡象,如體重減輕和外觀不良(圖6b),盡管G(IIKK)4I-NH2顯示出更高的體外溶血性。與PBS中的陰性對照相比,這兩種肽對腫瘤生長表現出明顯的抑制作用,其中G(IIKK)4I-NH2表現出比G(IIKK)3I-NH2更好的療效(圖6c),這與它們的體外抗腫瘤趨勢一致。18天后,解剖腫瘤并稱重(圖6a和d)。在1.5 mg/kg和5 mg/kg劑量下,G(IIKK)3I-NH2治療組的腫瘤生長抑制率分別為0.23和0.31。G(IIKK)4I-NH2能產生更有效的抑制作用,在1.5 mg/kg和5 mg/kg劑量下,抑制率分別為0.32和0.41。這些數據表明,在小鼠異種移植模型中,螺旋肽可以有效地抑制腫瘤生長,而腫瘤細胞不能被完全清除。許多抗腫瘤藥物的不完全抑制作用已被廣泛觀察到,這可歸因于多種機制,例如藥物從腫瘤部位相對較快地清除,以及它們難以通過壞死區域擴散[42],但目前這組肽背后的確切原因有待進一步的機理研究。

圖6。人宮頸癌裸鼠移植瘤的體內抗腫瘤作用。(a)給藥后解剖腫瘤。(b)給藥期間體重變化。(c)給藥期間腫瘤體積的變化。(d)給藥后的腫瘤抑制率。


4.討論


這些設計的肽短而規則。與典型的天然AMPs和流行的抗癌藥物順鉑相比,它們在抑制癌細胞生長方面的結構簡單、效力高、副作用小,使它們成為基礎研究和應用研究的理想模型和靶點。這些肽在界面性質和生物活性方面表現出系統性的變化。我們面臨的直接挑戰是如何將分子結構設計、界面性質和破壞細胞膜的選擇性聯系起來。這代表了功能性生物材料研究的核心努力,從而在未來肽抗生素的合理設計和對其抗腫瘤性能的理解中獲得更好的分子洞察力。


我們之前在共培養環境下使用NIH 3T3細胞系作為宿主細胞的研究表明,這些肽對細菌和癌細胞的作用模式大致相似,并解釋了為什么它們不會對正常哺乳動物細胞造成傷害[8]。由于磷脂酰絲氨酸、O-糖基化粘蛋白、唾液化神經節苷脂和硫酸肝素的表達升高,腫瘤細胞膜也攜帶凈負電荷。這種外膜表面的負電荷特征與細菌非常相似。這些肽和靶膜之間的靜電相互作用對選擇性反應至關重要。


在所研究的短肽系列中,G(IIKK)3I-NH2代表了體外抗癌活性和細胞選擇性方面的最佳鏈長,與之前報道的抗菌活性和選擇性觀察結果一致。已經證明,對細菌和癌細胞的共同區別反應源自肽通過靜電相互作用和疏水效應之間的平衡對不同細胞膜的選擇性反應。具體而言,負表面電荷和高度不飽和脂鏈驅動的對癌細胞的高親和力導致G(IIKK)3I-NH2與癌細胞膜的快速結合,并隨后導致膜通透性。肽分子隨后通過脂質雙層轉移,并積聚在癌細胞內部。這一過程產生了一系列細胞凋亡的形態學和生化特征,表明肽處理的癌細胞因膜破壞和凋亡而死亡。此外,這項工作還揭示了肽誘導的癌細胞凋亡與兩個特征性的分子過程有關:線粒體途徑和死亡受體途徑。


這些肽在與淋巴細胞相互作用后不會誘導非特異性免疫原性反應,重要的是,它們在裸鼠體內對異種移植物顯示出相當大的生長抑制作用,對宿主毒性很小,因此表明它們在臨床開發中具有巨大潛力。這些數據共同構成了設計具有優異生物相容性和選擇性的短肽生物材料的新范例的基礎。迄今為止,許多AMP通過從天然蛋白質和肽中提取氨基酸序列來強調仿生作用。相比之下,在目前的工作中,我們采用了IIKK序列模塊基本單元的最小模擬,然后采用人工重復(n)和選擇性終端阻斷,從而大大提高了性能。未來的工作可以評估仿生學如何與合理的結構設計相協調。目前尚不清楚一級序列的變化,例如用L、V和A替換I,或用R替換K,以及任何帶有短側鏈的非天然陽離子氨基酸,將如何改變效力和選擇性。


另一方面,雖然短肽對不同細胞類型的選擇性反應符合實驗觀察結果,但細胞外膜表面精細而復雜。目前基于選擇性靜電相互作用的解釋充其量只能是一種簡化的合理化。需要進一步研究,通過不同層次的模型界面表示來揭示詳細的分子過程,從而更直接地了解不同細胞和亞細胞界面上的不同相互作用。因此,目前的工作為探索新的科學理解開辟了一系列具有挑戰性但令人興奮的實驗機會。結合短設計功能肽開發相關的模型生物界面將促進新的實驗能力,包括各種表面和界面成像、反射和散射,使用激光、x射線和中子束源。這些實驗不僅將增加對生物界面過程的新理解,還將催生新技術。最后,之前的研究表明,表面活性劑樣短肽(如A9K)在抑制癌癥生長方面也表現出很高的效力和選擇性[11],但這些肽促進了水和膜樣環境下的b-折疊構象,而不是本研究中報道的a-螺旋構象。目前還不清楚如何不同的二級結構可能導致等效的高效力和選擇性,但具有明確的分子結構奠定了一個有用的基礎,為我們探討這些重要的差異,在未來的研究。對于從事跨學科研究的物理學家和材料研究人員來說,這些合理設計的模型比已經報道的各種天然AMP和同系物更易于處理。無論爭論的方向和結果如何,這些短肽都將引起廣泛的興趣來探索其功能用途。效力的變化有不同的含義。例如,很短的肽可以用于皮膚護理,而較長的、效力更大的肽可以用于治療開發。


5.結論


在一系列短肽G(IIKK)nI-NH2(n?1e4)中,G(IIKK)3I-NH2代表了體外抗癌活性和細胞選擇性方面的最佳鏈長,與之前在抗菌活性和選擇性方面的觀察結果一致。已經證明,對細菌和癌細胞的共同鑒別反應源于肽通過靜電相互作用和疏水效應之間的平衡而產生的選擇性反應。具體而言,負表面電荷和高不飽和脂鏈驅動的高親和力導致G(IIKK)3I-NH2與癌細胞膜的快速結合和隨后的膜通透性。然后,肽分子通過脂質雙層轉運,并在癌細胞內部積聚。這一過程產生了一系列細胞凋亡的形態學和生化特征,表明肽處理的癌細胞因膜破壞和凋亡而死亡。此外,這項工作還揭示了肽誘導的癌細胞凋亡與兩個特征性的分子過程有關:線粒體途徑和死亡受體途徑。最后,該肽在與淋巴細胞相互作用后不會誘導非特異性免疫原性反應,重要的是,這些設計的肽在異種移植模型中顯示出相當大的體內抗腫瘤作用,而毒性很小,這兩者都表明它們作為功能材料在生物技術和臨床應用中的潛力。


致謝


這項工作得到了中國國家自然科學基金資助31271497,30900765號和21033005號,山東省自然科學基金(ZR2009 9DQ00 1和JQ201105)和中央大學基礎研究基金(12CX04052A)的資助。我們還感謝英國工程和物理科學研究委員會(EPSRC)的支持。我們感謝英國皇家學會(倫敦)為HX提供中英獎學金。

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